DESENHO E OTIMIZAÇÃO DE REAÇÃO DE QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR MÉTODO SYBR®GREEN EM SISTEMA DE PCR EM TEMPO REAL (QRT-PCR) PARA O GENE DO FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMANTE BETA 1 (TGFB1)

INTRODUÇÃO: O fator de crescimento transformante beta (TGFB) e as vias de sinalização que o envolvem são de extrema importância para diversos processos biológicos no corpo humano, incluindo regular a formação do cérebro, principalmente a neurogênese. Especificamente a proteína TGFB1 é ativa nas meninges e plexo coroide do sistema nervoso central (SNC) de um adulto saudável, enquanto as variantes TGFB2 e TGFB3 estão menos ativos e coexpressos. Nesse sentido, quando ocorrem traumas agudos no SNC, eleva-se a ativação da cadeia do TGFB1, o que indica sua ação positiva nos distúrbios neurológicos. Se essa via for danificada, seja por trauma agudo, distúrbio do desenvolvimento, doenças que afetam o metabolismo, a formação ou manutenção do sistema neuronal do indivíduo ficarão afetadas. OBJETIVOS: Por isso, este trabalho teve o objetivo de propor o desenho e otimização de um protocolo que analise a expressão gênica do TGFB1 pelo método SYBR®Green de mulheres gestantes que foram infectadas pelo COVID-19 durante a gestação. MATERIAIS E MÉTODO: Foram realizadas análises in sílico das sequências do gene TGFB1, usando os softwares Nucleotide-Blast, Primer-Blast (NCBI) e DINAmelt. Após a síntese dos primers, foram realizados testes com diferentes concentrações dos primers e diferentes protocolos de reação. Análises de diferentes amostras foram realizadas evidenciando a detecção da expressão gênica. RESULTADOS: O desenho dos primers ocorreu em diferentes éxons para o primer senso e antisenso, que foram capazes de detectar todos os transcritos expressos pelos leucócitos. Isso resultou no desenvolvimento de 10 pares de primers para o TGFB1 com características como tamanho, percentual de guanina (G) e citosina (C), baixa repetição de G e tamanho dos fragmentos amplificados. Os oligos resultantes foram testados para especificidade e validados através da comparação com sequências depositadas no banco de genes do NCBI, utilizando a ferramenta Nucleotide BLAST. Testou-se pelo software DINAmelt a existência de possíveis dímeros entre os primers senso e antisenso, considerando para a pesquisa a sequência com menor taxa de formação desses dímeros. Ademais, a extração foi feita utilizando o método descrito pelo fabricante do Trizol LS Reagent (ThermoFisher). Após a eluição do reagente em água ultrapura livre de RNAse e DNAse e a diluição para a solução de uso, foi realizado o teste da expressão do TGFB1 nas amostras das gestantes do projeto, permitindo a qualificação da expressão nestas amostras. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A técnica desenvolvida permitiu uma análise adequada da expressão do TGFB1 a partir do RNA obtido de células do sangue periférico, e pode ser empregada em pesquisas que se baseiem na análise deste importante gene regulador das atividades de neurogênese e da resposta imune.

PALAVRAS-CHAVE: Fator de crescimento transformante beta 1; expressão gênica; fatores imunológicos