DESIGN E OTIMIZAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DO BDNF POR QRT-PCR BASEADO EM SYBR®GREEN PARA ESTUDOS EM PACIENTES COM MIGRÂNEA

INTRODUÇÃO: A migrânea é caracterizada por episódios recorrentes de cefaleia intensa, frequentemente acompanhada de náusea, vômito e hipersensibilidade à luz e ao som. Embora sua fisiopatologia não seja completamente compreendida, sabe-se que envolve a ativação do sistema trigeminovascular e a liberação de neuropeptídeos, interleucinas e neurotrofinas. O BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro) é uma dessas neurotrofinas que desempenha um papel crucial na plasticidade sináptica, sobrevivência neuronal e modulação da dor, sendo estudado como um possível biomarcador da migrânea, especialmente em casos associados à aura. OBJETIVOS: Este estudo teve como objetivo principal desenvolver e padronizar um protocolo de qRT-PCR utilizando o corante fluorescente SYBR®Green para quantificar a expressão do gene BDNF em pacientes com migrânea MATERIAIS E MÉTODO: O RNA total foi obtido a partir de leucócitos do sangue periférico. Antes dos ensaios com RNAm, foi realizada a validação das amostras através de RT-PCR para o gene da β2 microglobulina (B2M), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e 18S. A síntese de DNA complementar foi realizada a partir de 500ng do RNA total, e testes com diluição do DNAc foram realizados através de uma curva padrão com a identificação da melhor eficiência de amplificação. O gene alvo BDNF foi analisado a partir de ferramentas de bioinformática, com a identificação de duas sequências de primers, senso e antisenso, para reação de quantificação da expressão. Após testagem in silico, foi padronizada uma reação de PCR quantitativo no sistema de detecção QuantStudio 3 (Thermo Fisher), com posterior análise da curva de melting. Um ensaio piloto foi realizado a partir de oito amostras de RNA total, sendo 4 amostras de pacientes com migrânea e 4 amostras de indivíduos sem histórico ou diagnóstico de migrânea. RESULTADOS: Após o desenho dos primers utilizando ferramentas de bioinformática, foi desenvolvido um protocolo para análise da expressão de RNA mensageiro do BDNF, que permitiu quantificar a expressão relativa. O ensaio piloto revelou que havia expressão do BDNF superior ao gene referência (18S) em todas as amostras, incluindo dos pacientes com migrânea e de indivíduos controle. Porém os resultados não indicaram uma diferença significativa na expressão deste gene (p>0,05). CONSIDERAÇÕES FINAIS: O estudo conclui que o protocolo de qRT-PCR desenvolvido é eficaz para quantificar a expressão do gene BDNF em amostras de RNA total, fornecendo uma ferramenta útil para investigações futuras sobre os mecanismos subjacentes à migrânea. Esses resultados preliminares indicam que estudos adicionais com amostras maiores são necessários para explicar possíveis diferenças na expressão. Acredita-se que a expressão do BDNF pode ser explorada como uma ferramenta de avaliação da severidade da doença, com o potencial de personalizar o tratamento da migrânea e melhorar a qualidade de vida dos pacientes afetados por essa condição incapacitante.

PALAVRAS-CHAVE: Biomarcador; Neurotrofina; Cefaleia; Genética molecular