DESIGN E PADRONIZAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DO GENE IL1B

INTRODUÇÃO: A migrânea é uma doença neurológica crônica altamente incapacitante, sua fisiopatologia ainda não foi totalmente elucidada, mas a teoria mais aceita atualmente baseia-se na ativação do nervo trigêmeo com liberação de Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) e substância P (SP) em suas terminações nervosas gerando uma cascata de estímulos que desencadeia inflamação neurogênica e dor. A Interleucina (IL) 1β é uma citocina pró-inflamatória muito importante na fisiopatologia da migrânea, ela é capaz de agir sobre os nociceptores e modular a sensibilidade dolorosa, além disso, estudos demonstraram o aumento plasmático dessa citocina em pacientes portadores de migrânea. Sendo assim, analisar a expressão gênica dessas citocinas envolvidas no eixo da resposta inflamatória da migrânea como a IL-1β é muito importante para definir alvos tanto diagnósticos quanto terapêuticos para a doença. OBJETIVOS: Esse projeto tem como objetivo o desenho e padronização de primers para estudos de expressão gênica em pacientes com migrânea através de PCR em tempo real (qRT-PCR) baseados em SYBR®Green. MATERIAIS E MÉTODO: Foram construídas 5 sequências de opligonucleotídeos para o gene IL1B a partir de sequência de genoma depositada no Genbank (NCBI). Realizado um alinhamento utilizando o algoritimo Clustal W, mapeadas as regiões conservadas e selecionado os primers. Posteriormente submetidos à análise dos parâmetros especificidade, pela ferramenta BLAST, concentração de GC%, TMelting, comprimento, formação de dímeros e hairpin utilizando o software Oligo Analyser, validando-os para uso in vitro. RESULTADOS: A diluição de DNAc que apresentou o Ct entre os valores de CTs 18 a 22 foi de 1:2. A análise da curva de melting foi realizada no final da reação para verificar artefatos como dímeros de primers e contaminação. Pode-se observar que em nenhum caso, tanto para o gene alvo quanto para o constitutivo houve detecção de picos adicionais na análise da curva de melting, evidenciando uma alta homologia e identidade dos primers desenhados com a sequência correspondente aos genes. Por fim, após a análise de 4 amostras distintas, a concentração de entrada do RNA total (300ng/uL, a diluição 1:2 do DNAc, a diluição e concentração dos primers na reação, e a análise do gene alvo podem ser utilizados como padrão nas pesquisas de expressão gênica relativa através da técnica de SYBR®Green. CONSIDERAÇÕES FINAIS: Assim, esse estudo se mostra importante em várias áreas do conhecimento, visto as diversas possibilidades de desenvolvimento de metodologias de quantificação e utilização dos iniciadores para técnicas diagnósticas e estudos de terapias alvo tanto para a migrânea quanto para outras doenças agudas ou crônicas.

PALAVRAS-CHAVE: Migrânea; Interleucina-1β; PCR; primers.