DESIGN E PADRONIZAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA PARA O GENE IL10 POR QRT-PCR BASEADO EM SYBR®GREEN PARA ESTUDOS EM PACIENTES COM MIGRÂNEA

INTRODUÇÃO: A migrânea é uma desordem neurológica, caracterizada por dor geralmente unilateral, pulsátil de moderada a forte intensidade, responsável por alta incapacidade dos pacientes. A enxaqueca atinge todas as idades e sexo, porém é notado maior incidência entre as mulheres, principalmente entre o período de puberdade e menopausa. Fisiopatologicamente complexa, comprometendo o sistema nervoso, relacionada a vasodilatação e ativação da via trigeminal da dor, no qual estão envolvidas diversas substâncias que modulam sua nocicepção, como as citocinas anti-inflamatórias. A interleucina 10 (IL10) parece ser um dos mediadores desse processo, assim, a análise da sua expressão gênica, feita por qRT-PCR, tem grande importância para melhor entendimento e possíveis avanços no diagnóstico e tratamento dessa doença. OBJETIVOS: Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo o desenho e padronização de primers e análises para estudo da expressão genica do gene IL10 por qRT-PCR baseado na técnica de SYBR®GREEN. MATERIAIS E MÉTODO: A primeira etapa do estudo foi a coleta de dados do gene IL10 e as possíveis regiões alvo para design dos primers, através de banco de dados (GenBank) da plataforma NCBI. O trabalho seguiu com o desenho dos primers (Forward e Reverse), que contemplassem as características exigidas para sua fabricação, estudo de estruturas secundárias entre os primers (DINAmelt) e amplicons (Mfold) e avaliação da especificidade (BLAST). Após as análises in silico, as sequências foram confeccionadas e testadas, com a padronização da reação de qRT-PCR. RESULTADOS: Foram inicialmente desenhados 3 pares de sequências de primers, os quais não obtiveram sucesso dentre os parâmetros de formação de homodímeros e hairpins, fazendo-se necessário o design de um novo par. O novo par de primers (Forward e Reverse) escolhido apresentava percentual de G/C de 34,78 e 38,10%, Temperatura de melting (Tm) entre 54.6 e 54.3°C e tamanho de 23 e 21 pb. As análises in silico confirmaram a especificidade dos primers selecionados, bem como a ausência de formação de estruturas secundárias. A seguir, foi realizada a padronização da reação e análise das curvas padrões, revelando a possibilidade de avaliação da expressão gênica do gene IL10 por meio da tecnologia de SYBR®Green. CONSIDERAÇÕES FINAIS: Deste modo, podemos concluir que estudos de expressão gênica podem ser realizados por meio da tecnologia SYBR®Green, à custos baixos e em larga escala.

PALAVRAS-CHAVE: Interleucina-10; qRT-PCR; desenho de primers; SYBR®Green