DESIGN E OTIMIZAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DO TNFA POR QRT-PCR BASEADO EM SYBR®GREEN PARA ESTUDOS EM PACIENTES COM MIGRÂNEA

INTRODUÇÃO: A migrânea, que é comumente chamada de enxaqueca, afeta cerca de um bilhão de indivíduos no mundo, e é um distúrbio neurológico que ocupa a segunda posição entre as doenças que causam incapacidade social e laboral. A fisiopatologia ainda não é bem estabelecida, mas considera-se que exista a o envolvimento de uma neuroinflamação relacionada ao sistema trigeminovascular e seus sinais nociceptivos gerados durante a ativação do nervo craniano. Dentre as citocinas pró-inflamatórias envolvidas destaca-se a IL- 1β e IL-6 e o TNF-α. Este libera prostanoides, estimulam a expressão de receptores de bradicinina, aumentam a neutrofina fator de crescimento nervoso, modulam a atividade dos neurônios simpáticos e o estimulam a transcrição do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina. Alguns estudos demostraram que os níveis de TNF-α estão aumentados em pacientes que sofrem de enxaqueca, tanto nos períodos de remissão quanto nos de crise. OBJETIVOS: Neste sentido o objetivo dessa pesquisa foi desenvolver e otimizar um protocolo para a análise da expressão gênica do TNFA em pacientes com migrânea pelo método SYBR®GREEN. MATERIAIS E MÉTODO: Este projeto possui aprovação no comitê de ética em pesquisa envolvendo seres humanos Pontifícia Universidade Católica do Paraná sob o protocolo nº 98316718.7.0000.0020. Neste estudo experimental buscou-se e identificou-se a sequência do TNFA em bases de dados genéticos, utilizando o National Center for Biotechnology Information (NCBI). Foram selecionadas sequências que representassem diferentes tipos de transcritos para o gene com a finalidade de desenhar primers em éxons distintos do TNFA. RESULTADOS: Pelo menos três pares de primers foram desenvolvidos com características específicas, como tamanho, conteúdo de guanina e citosina e tamanho dos fragmentos amplificados. Os primers foram testados quanto à especificidade e validados comparando-os com sequências depositadas no banco de genes usando a ferramenta BLAST. A formação de possíveis dímeros entre os primers também foi testada. As possíveis estruturas secundárias formadas a partir do fragmento do TNFA foram analisadas pelo software Mfold. Após a análise in sílico, o RNA foi extraído de amostras de sangue periférico de pacientes com migrânea e indivíduos sem migrânea. Reação de transcrição reversa foi realizada com o RNA total para gerar o DNA complementar, que seria amplificado posteriormente pelo qRT-PCR. A qRT-PCR foi padronizada para estudar a expressão gênica do TNFA, e a curva padrão foi obtida para avaliar a eficiência da amplificação e a consistência entre réplicas. Após avaliação de amostras de pacientes, foi observada a detecção da expressão específica do TNFA. CONSIDERAÇÕES FINAIS: O projeto PIBIT alcançou seus objetivos ao concluir o desenho do primer do gene TNFA usando a técnica qRT-PCR com SYBR®Green. Essa conquista permitirá futuros estudos para quantificar o TNFA em pacientes com migrânea e em outros projetos, otimizando o tempo e reduzindo os custos de pesquisa com uso de metodologia de menor custo. Os resultados destacam a importância da pesquisa realizada e sua relevância para a área.

PALAVRAS-CHAVE: Transtornos de enxaqueca; citocinas; TNFA; doenças neuroinflamatórias; bioinformática