CARACTERIZAÇÃO DE VESÍCULAS EXTRACELULARES EXTRAÍDAS DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ISOLADAS DE POLPA DE DENTE PERMANENTE

INTRODUÇÃO: Células-Tronco Mesenquimais (CTM) são células adultas com capacidade de autorrenovação, habilidade de diferenciar em vários tipos celulares e atividade parácrina e imunomoduladora. O tecido dentário tem várias fontes de CTM, incluindo as Células Tronco da Polpa Dentária (DPSC). Terapias baseadas em células têm resultados promissores, mas há interesse em materiais derivados de células para fins terapêuticos. As Vesículas Extracelulares (VE) têm uma vantagem na medicina regenerativa por serem mais seguras quando comparadas às CTM. As VE são essenciais na comunicação celular, transportando biomoléculas que podem influenciar o microambiente. Considerando a quantidade limitada de VE, induzir a liberação de vesículas de membrana a partir da superfície das células apresenta uma alternativa para seu isolamento. Para explorar esse potencial terapêutico, métodos de isolamento melhores precisam ser testados, assim como diferentes técnicas. OBJETIVOS: Caracterizar vesículas extracelulares extraídas de células-tronco mesenquimais isoladas de polpa de dente permanente utilizando Citocalasina B. MATERIAIS E MÉTODO: O estudo foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa (5.577.444). As DPSC foram isoladas, cultivadas e caracterizadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo. As células foram cultivadas a 2% e 15% de soro bovino fetal (SBF) por 24h e sem SBF (serum-free) por 24 e 72 horas antes da extração das VE para comparação. As VE foram extraídas utilizando Citocalasina B e subsequentemente caracterizadas. A quantificação indireta foi realizada no equipamento Qubit™ 4.0 e a análise direta de partículas em suspensão foi realizada através da técnica de Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) pelo equipamento Nanosight. A caracterização morfológica foi realizada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Para confirmar a ausência de DNA nas amostras de VE foi utilizado o corante fluorescente DAPI e as amostras foram observadas em microscópio. RESULTADOS: As DPSC exibiram morfologia fibroblastóide e expressão de marcadores de superfície de acordo com o preconizado pela Sociedade Internacional de Terapia Celular e Gênica. As VE extraídas das DPSC cultivadas em meio contendo 2% de SBF apresentaram dimensões médias de 174.9±2.7nm, com concentração média de 1.61x10e10±3.02x10e7 partículas/mL. Já as vesículas extraídas de DPSC cultivadas em meio contendo 15% de SBF mostraram dimensões variando entre 74.8nm e 241.3nm, com média de 139.4±2.2nm e concentração média de 1.79x10e10±4.39x10e7 partículas/mL. As vesículas obtidas de DPSC cultivadas em meio serum-free por 24 horas apresentaram dimensões médias de 169±4.6nm, com concentração média de 2.47x10e10±8.31x10e6 partículas/mL. Por fim, as VE extraídas de DPSC cultivadas em meio serum-free por 72 horas tiveram dimensões médias de 173.3±2nm, com concentração média de 4.28x10e10±3.76x10e7 partículas/mL, sendo a amostra com o melhor rendimento e pureza. A análise de MET confirmou a morfologia e tamanho comumente observados nas VE. Além disso, os níveis reduzidos de ligações DAPI indicam que o conteúdo de DNA nas VE é escasso. CONSIDERAÇÕES FINAIS: Os resultados demonstram a eficácia do protocolo de isolamento para as VE extraídas de DPSC utilizando Citocalasina B. As VE podem ser utilizadas na medicina regenerativa e os resultados enfatizam a importância da otimização dos protocolos de isolamento e condições de cultivo para maximizar a produção e eficácia terapêutica das VE.

PALAVRAS-CHAVE: Exossomos; Medicina Regenerativa; Métodos de Isolamento.