ANÁLISE GENOTÍPICA DE VARIANTES DOS GENES LRRK2 E NOD2, E IMUNOFENOTIPAGEM DE CÉLULAS HUMANAS

INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença estigmatizante e ainda endêmica no Brasil, cujo agente etiológico principal é o bacilo Mycobacterium leprae que infecta primariamente os macrófagos da pele e as células de Schwann do sistema nervoso periférico. Dallmann-Sauer M. et al. apontam para variantes dos genes LRRK2 e NOD2 como candidatas a controlar o tempo de incubação da doença. Como parte da estratégia de estudos subsequentes, definimos a oportunidade de compor um banco de dados genotípico das variantes desses genes, buscando voluntários residentes em Curitiba, e de caracterizar imunofenotipicamente células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de portadores das variantes em estudo. OBJETIVOS: Expandir o banco de amostras biológicas do grupo de pesquisa proponente, através do recrutamento e caracterização genotípica e fenotípica de amostras de PBMC de indivíduos recrutados a partir de uma população de Curitiba. MATERIAIS E MÉTODO: Foram coletados 4ml de sangue periférico através de punção venosa. Uma segunda coleta de 40ml de sangue periférico ocorreu em indivíduos portadores dos genótipos de interesse. O DNA foi extraído a partir das amostras de sangue pelo método salting out. As variantes-alvo foram genotipadas por discriminação alélica baseada em fluorescência. Amostras de PBMC de indivíduos portadores dos genótipos de interesse foram isoladas, cultivadas e monócitos induzidos em macrófagos utilizando-se GM-CSF. A caracterização imunofenotípica foi realizada por citometria de fluxo, utilizando-se anticorpo CD14. RESULTADOS: Foram recrutados 198 voluntários e dois indivíduos possuíam homozigose para as variantes raras de LRRK2, mas não para NOD2. As frequências alélicas e genotípicas obtidas são semelhantes aos dados da população americana e europeia. Foram isolados e plaqueados PBMC de 5 indivíduos selecionados, utilizando como critério o genótipo apresentado. Todos os monócitos induzidos foram diferenciados em macrófagos com sucesso. Todos os macrófagos obtidos expressaram CD14. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A criação do banco de dados genéticos amplia o conhecimento sobre a frequência e a distribuição dessas variantes na população estudada e fornece subsídio importante para estudos subsequentes. A utilização de GM-CSF para a diferenciação de monócitos em macrófagos foi eficaz; os resultados obtidos no cultivo celular validam os métodos utilizados em nosso laboratório, abrindo a possibilidade de serem empregados em outros experimentos.

PALAVRAS-CHAVE: hanseníase; Genética; Imunofenotipagem.