ESTABELECIMENTO DE UM PROTOCOLO DE AVALIAÇÃO DA PROPRIEDADE IMUNOMODULADORA DAS CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS DA MEDULA ÓSSEA

INTRODUÇÃO: As células estromais mesenquimais (CEM) secretam fatores bioativos com ação imunomoduladora em resposta às citocinas pró-inflamatórias e tais fatores atuam em diferentes células do sistema imune, promovendo um efeito anti-inflamatório. Por este motivo, as CEM-MO têm sido utilizadas em ensaios clínicos para o tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Para uma maior atividade imunomoduladora as CEM-MO podem ser estimuladas (priming) com citocinas inflamatórias como IFNγ e TNFα, aumentando a capacidade imunossupressora. As CEM-MO são consideradas Produtos de Terapia Avançada (PTA), os quais devem passar por controles de qualidade de acordo com a legislação vigente para demonstrar a funcionalidade, visando o sucesso da aplicação terapêutica. Um dos testes funcionais é o ensaio do potencial de imunomodulação das CEM, onde é avaliada a capacidade de inibição da proliferação dos linfócitos T pelas CEM. OBJETIVOS: Caracterizar a atividade imunomoduladora in vitro das CEM-MO. MATERIAIS E MÉTODO: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUCPR (CAAE: 68585123.1.0000.0020). Foram utilizadas quatro amostras de CEM-MO de doadores saudáveis para a realização dos testes de imunomodulação. O protocolo 1 foi baseado na estimulação da proliferação dos linfócitos T, presente no pool de células mononucleares (CMN) do sangue periférico, com um mitógeno inespecífico, e o co-cultivo durante cinco dias com as CEM-MO. No protocolo 2 foi realizado o priming das CEM-MO com as citocinas IFNγ e TNFα, em diferentes condições e concentrações, co-cultivo com as CMN durante setes dias. Em ambas as metodologias a avaliação da proliferação dos linfócitos T, que são CD3 positivos, foi realizada por citometria de fluxo. RESULTADOS: Os dois protocolos foram eficazes para a determinação do potencial de inibição da proliferação de linfócitos T pelas CEM-MO. A inibição da proliferação dos linfócitos T, de acordo com os critérios definidos pelo CTC/PUCPR, deve ser acima de 50%. Em ambos os protocolos foi possível observar que o potencial de inibição de proliferação das células T foi acima de 50%, nas proporções 1 CMN: 10 CEM-MO no protocolo 1, e nas proporções 1 CEM-MO:10 CMN e 1 CEM:30 CMN no protocolo 2. Desta forma, estas proporções serão consideradas nos testes futuros para avaliar o potencial de inibição de proliferação de linfócitos T. CONSIDERAÇÕES FINAIS: Ambos os protocolos foram eficazes e demonstraram que as CEM-MO, tanto no estado basal como após estimulação com citocinas inflamatórias, apresentaram potencial de inibição de forma dose dependente. A imunomodulação foi aumentada na presença de citocinas como a IFNγ ou TNFα. Este estudo reforça a importância da padronização dos testes funcionais como controle de qualidade de um PTA para uso em ensaios clínicos na Medicina Regenerativa.

PALAVRAS-CHAVE: 1. Produto de terapia avançada; 2. Proliferação celular; 3. Linfócito-T; 4. Citocina pró-inflamatória; 5. Imunogenicidade.