INTRODUÇÃO: A monitorização sérica de medicamentos e drogas (TDM, do inglês, therapeutic drug monitoring) é muito importante na eficácia e na evolução de qualquer tratamento medicamentoso, tendo grande relevância em pacientes hospitalizados, fazendo com que a realização de TDM para antimicrobianos seja de extrema importância, devido ao fato das diferentes classes de antimicrobianos possuírem diferentes índices de Farmacocinética e Farmacodinâmica (PK/PD) ligados à atividade antimicrobiana, por isso o TDM tem como objetivo evitar a toxicidade do medicamento testado e otimizar a dose do medicamento para o paciente, fazendo com que essa prática possibilite que o tratamento seja completamente personalizado e individualizado para cara paciente, diminuindo então os riscos de efeitos adversos e praticamente eliminando gastos adicionais com tais intercorrências. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – high performance liquid chromatography) é um método analítico utilizado para determinar a concentração de um fármaco na amostra analisada, sendo considerada mais eficaz que o imunoensaio. – OBJETIVOS: Desenvolver protocolo de quantificação de vancomicina e gentamicina por HPLC em amostras biológicas, nas quais foram definidas o plasma humano e o líquido cefalorraquidiano (LCR – líquor), para que se possa manter a monitoração e os ajustes posológicos devidos seguindo metodologias farmacocinéticas e farmacodinâmicos (PK/PD) e para aplicação em amostras biológicas de pacientes que estão internados. – MATERIAIS E MÉTODO: Foram realizados testes de concentração de vancomicina em agua ultrapura, plasma, liquor. A metodologia de extração incluiu ácido perclórico para posterior passagem no HPLC usando fase móvel com acetonitrilo em pH corrigido. – RESULTADOS: Os resultados obtidos com as curvas de calibração da vancomicina em água e plasma foram considerados bons e, a partir desses resultados foi possível aplicar a metodologia utilizando amostras biológicas como plasma e LCR, entretanto os resultados nos fluídos biológicos não foram agradáveis e conclusivos, podendo comparar os resultados junto ao resultado de vancocinemia do paciente (realizado como rotina no hospital), avaliando assim a eficácia dos testes. A concordância de resultados por muito próxima a 100% (R2>0,99). – CONSIDERAÇÕES FINAIS: A comparação dos resultados de dosagem sérica de vancomicina e gentamicina por HPLC e por imunoensaio realizado como rotina no HUC foram essenciais para determinar que o protocolo de quantificação de vancomicina e gentamicina por HPLC com base em amostras biológicas (plasma e LCR) não foram satisfatórias. Entretanto, a realização das curvas de padronização em água e em plasma humano foram bem-sucedidas.